长期以来哨兵鼠方案在实验啮齿类动物的微生物质量监测中都扮演着重要角色，我国《实验动物微生物、寄生虫学等级及监测》（GB 14922-2022）也增加了可以“按要求选取哨兵动物”检测的描述。本文将就哨兵鼠方案展开讨论，与读者朋友们一起探讨如何设置哨兵鼠，不同设置方案的优缺点有哪些，并在此基础上与读者朋友们探讨如何制定适合自己设施的哨兵鼠监测方案。

哨兵鼠是用于监控实验大小鼠饲养环境中病原及病原感染的动物，一般与被监测动物遗传学背景相同，且微生物背景清晰。当被检测动物群体因数量庞大导致抽样检测成本过高；或被检测动物较为珍贵，不能轻易牺牲；又或被监测动物本身是免疫缺陷动物或者进行过基因改造免疫功能异常的情况下，不适宜直接抽检，在这些情况下，都需要使用哨兵鼠方案解决设施内动物微生物质量监控的问题。按照哨兵鼠与被监测动物的接触方式可分为直接接触哨兵鼠和脏垫料哨兵鼠，近年来国外一些机构还创新性使用了“废气哨兵鼠”。

直接接触哨兵鼠

直接接触哨兵鼠是将哨兵鼠和被监测动物放在同一个鼠笼内共同饲养至少4周, 通过直接接触促进微生物或寄生虫的暴露和传播，因此，该方案可以检测各种不同传播途径的微生物和寄生虫感染，包括直接接触，气溶胶，尿液和粪口途径，这也是该方案最大的优点。但这个方案最大的缺点是必须在每个笼子里放置哨兵动物，导致其只能在被监测动物数量很少的情况下才能使用，否则其监测成本将非常高昂，也正是因为这个原因，直接接触哨兵鼠的使用非常少。

脏垫料哨兵鼠

脏垫料哨兵鼠是以间接接触和延迟反馈的方式监测鼠群的微生物携带状况。可以使用相对较少的动物来监测更多笼动物，通常一到两笼哨兵鼠可以监测50-80笼动物，大大降低了监测成本，在监测成本和监测效果之间达成了良好的平衡，故而是长期以来最普遍采用的监测方案。尽管现在欧美许多设施正在用更新的排气口粉尘样本监测方案补充和替代它，但目前阶段，我国更多设施依然单独（主要）采用该方案。

通常而言，每面单独通风笼（IVC或EVC）的笼架可以设置1-2笼哨兵鼠笼，位置通常选择在最后一个回风位，每笼一般放2-3只哨兵鼠，每次换笼时将每笼被监测动物的脏垫料（含粪便）取30-50g到哨兵鼠笼中，哨兵鼠笼中使用50%-100%的脏垫料，以确保有足够多的微生物和哨兵动物接触。如果所有被监测笼的脏垫料加在一起量太多，可以减少新鲜垫料的比例，如果还是太多，则可以充分混匀所有脏垫料后再取出一部分。

在被监测动物中，感染自限性病毒(如小鼠轮状病毒、小鼠肝炎病毒、小鼠肺炎病毒等)的免疫健全动物的病毒脱落量会随着时间推移而减少，直到最终大多数感染被宿主免疫系统清除。因此为了最大限度地提高检出率，应该尽量减少脏垫料的稀释，哨兵笼可全部使用脏垫料而不加入干净垫料。但即便是如此，在单独通风笼具广泛使用的今天，仍有可能会出现某种病原体在非常有限的笼盒内低密度流行的情况，这时，转入哨兵笼中的脏垫料所携带的有传染性的病原体的量可能不足以感染哨兵动物，由此就会造成一定程度的漏检。

脏垫料哨兵鼠能有效监测通过粪-口途径传播的病原体，如小鼠肝炎病毒、呼肠孤病毒等，但对于主要通过气溶胶、直接接触等途径传播的病原体，其监测效果就不尽如人意了，例如：仙台病毒、嗜肺巴斯德杆菌、肺支原体等。

为了让可能存在的病原体有足够的时间定植和传播，应将哨兵暴露在脏垫料中至少四周。由于这种滞后性，对于那些新购入需要尽快完成检疫进入设施的动物、需要快速反馈微生物结果的动物等，脏垫料哨兵鼠的滞后性无法满足其需要。

废气哨兵方案

随着更多的单独通风笼具系统的使用，利用排风口粉尘来监测动物微生物质量的方案正变得越来越流行。这种方案也有两个形式：

第一种是从单独通风笼具的所有笼盒排出的废气被输送到装有哨兵动物的笼子，这直接使哨兵动物暴露在废气中，同样的，暴露于废气的动物至少要暴露一个月，以确保哨兵动物感染可能存在的微生物（见图1），这种方法使得通过气溶胶传播的病原体能成功感染哨兵鼠，可以改善监测效果，不过可能是由于需要额外使用特殊的哨兵笼通风装置，该方法的应用并不广泛。

图1:废气哨兵鼠笼空气流向[1]

（引自BioZone, Inc.）

第二种是使排出的空气流过装有粉尘收集介质，直接用PCR方法检测该介质，也就是我们常说的通风口粉尘（Exhaust Air Dust，EAD）检测。目前这种方法被更广泛地应用于欧美许多设施的实验动物微生物监测。与脏垫料哨兵鼠方案相比，EAD方案的时效性和检出率都有了显著提升，最快暴露后一周就可检出，且在感染比率非常低（1/63）的情况下就可以成功检测到感染因子。目前国外的笼具品牌Tecniplast、Allentown以及我国笼具品牌新华医疗等都推出了专门针对自己的笼具系统所设计的通风口粉尘收集器，尽管它们不是真正的哨兵“鼠”，但承担着同样的角色。

不过，这种方法也并非完美，在使用前，有几个问题需要了解：

（1）笼盒、笼架设计和EAD监测方案的有效性密切相关，如果从笼盒中排出的空气经过过滤后再排到主管道，那采集的出风口粉尘是无法检测到病原体核酸的。

（2）如果设施中曾经发生过微生物污染，且笼架通风管道清洗中未清除干净所有核酸片段，那就可能造成假阳性结果。

（3）为保证检测结果的可靠性，通常建议将样本外送到专业的检测机构进行分析。而这可能会使得直接检测成本较脏垫料哨兵鼠方案更高。

从以上的介绍可以看出，每种方案都有自己的可取之处，也同时有难以避免的缺点，因此在制定监测方案时，许多设施会同时使用多个方法，以确保最佳的检测结果。

哨兵鼠的选择标准

除过滤介质排风系统外，所有啮齿动物健康监测项目都需要使用活体啮齿动物。以下是选择哨兵动物时需要考虑的标准:

来源:哨兵动物应来自经批准的、信誉良好的供应商或能够提供完善质量检测证据的设施。用作哨兵鼠的动物不应携带所需监测的所有病原体。

品系: 选作哨兵鼠的动物品系至关重要，常用的品系有ICR小鼠、SD大鼠等。通常要遵循的原则有：对所监测的病原体易感、与被监测动物的（背景）品系一致、易于发生血清转化、价格相对低廉。有些品系的动物对特定病原体的易感性低，应该避免选作哨兵鼠，例如SJL小鼠对呼吸株MHV病毒不易感、C57BL/6对MPV有抗性，还有DBA/2会存在抗体转化延迟，也不适宜作为哨兵鼠。

有少数设施会选择免疫缺陷小鼠（例如裸鼠或有毛杂合子）作为哨兵鼠，其感染病原体后表现为持续感染，可提高检出率；而裸鼠在监测牛棒状杆菌等免疫健全小鼠不易感的病原体方面会有更好表现。但是由于免疫缺陷动物感染这些病原体后更容易造成更为严重的疾病，因此面临动物福利方面的挑战。

性别: 通常认为雌性比雄性更适合做哨兵，因为雄性动物更容易打架，造成伤害，且雄性动物可能会导致被监测动物计划外怀孕造成基因污染。如果要使用雄性动物可以去势后再使用。

年龄: 通常选择在4-6周龄(最大不超过10周龄)的动物作为哨兵鼠。这是为了确保小鼠较好的免疫能力，且不会患上与年龄相关的疾病。

替换: 一旦哨兵笼中有一个哨兵动物被取出，应该在1-2周内补充。这将最大限度地增加病原体暴露的可能性，并使新动物在下一轮检测之前完成抗体转化。

哨兵鼠采样

通常，哨兵鼠至少要与被监测动物或其脏垫料、废气接触至少4周才可用于检测，这是因为免疫系统需要1-2周才能完成血清转化，部分病原体，例如小鼠诺如病毒则需要长达8周的时间才能完成血清转化。同时，细菌和寄生虫也需要一定时间定植和增殖到可检出水平。

检测频率通常建议是每季度检测一次，但是对于那些动物种类多、数量大、人员进出频繁、操作频繁的设施，以少量多次的形式可以更好提高检出效率，例如，每月检测一次。而对于那些长期都没有检出的病原体，也可参考FELASA推荐的做法，降低检出频率，例如，每半年或一年检测一次。

关于哨兵鼠的设置，读者朋友们还期望关注那些内容或者有哪些经验分享，欢迎在本号留言。

 

References：

1.Compton SR, Homberger FR, MacArthur-Clark,J. Microbiological monitoring in inpidually ventilated cage systems. Lab Anim (NY) ，2004，33:36-41.

2.https://www.taconic.com/taconic-insights/quality/rodent-sentinels.html

3.https://www.jax.org/news-and-insights/2005/may/using-sentinels-in-mouse-rooms

4.https://www.criver.com/resources/info-pi-rm-guidebook-strategies-infection-surveillance

5.赵勇, 范春, 朱闽娟,等. 屏障环境的哨兵动物应用[J]. 实验动物与比较医学, 2020, 40(1):4.